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组织分离法简单易行，后代变异小，能保菌株的优良特性，它是生产上常用的菌种分离法。种菇应选择外观典型，大小适中，菌盖表面鳞片较少，颜色纯白无病虫害的头潮菇，采摘种菇应在鸡腿菇生长的棒状后期或梭形前期。

母种培养基可选择PDA培养基，也可用如下配方：小麦600克，鲜子实体100克，葡萄糖20克，蛋白胨3克，磷酸二氢钾0.5克，磷酸氢二钾1克，硫酸镁1克，硫酸钙1克，琼脂25克，水1000 毫升。母种培养基的制作过程及无菌分离技术同其它食用菌制种技术，不再介绍。

鸡腿菇原种制作多采用麦粒种，其配制方法如下：麦粒浸泡24小时左右，至麦粒露白，用清水冲洗后煮沸20～25分钟，捞出沥干水后加1％石膏粉，20％已粉碎的麦秆发酵料，康明斯OEM然后装瓶，灭菌、无菌接种与培养。此配方菌丝生长旺盛，生长速度快，在25℃环境下750毫升菌种瓶12~15天可长满瓶。
鸡腿菇栽培种培养基多用棉壳、麦秆发酵料配制。配方如下：麦秆牛粪发酵料33%、麸皮10 %、棉籽皮50％、康明斯OEM玉米粉5％、石灰2%。先将麦秆粉碎中加牛粪20％～30%，加石膏2％，堆积发酵5～6天，然后加入其它原料，发酵48小时即可装袋灭菌，无菌接种与培养。此配方比单纯用发酵料及单纯用棉籽皮有发酵快、菌丝壮的优点。